Western blot Antibody Troubleshooting guide

Problem 1: No bands observed

가능한 원인	해결 방법
Insufficient antibody	Ø Target protein에 항체의 affinity가 낮은 것이 원인일 수 있으므로, 항체의 적용 농도를 높여볼 것 (추천 시작 농도보다 2~4배 높게) Ø 항체가 활성을 잃은 경우, Dot blot을 해 볼 것.
Insufficient protein	Ø 젤에 로딩하는 protein의 양을 늘려볼 것. Ø 다른 방법으로 protein의 농도 측정을 해 볼 것 Ø Positive control을 사용할 것 (recombinant protein, cell line or treat cells to express analyte of interest). Ø Dot blot을 해 볼 것.
Poor transfer	Ø PVDF/Immobilon-P membrane은 methanol이나, nitrocellulose membrane은 transfer buffer에 적실 것.
Incomplete transfer	Ø Transfer 시간을 조절 해 볼 것. 일반적으로 MW가 큰 protein은 좀 더 긴 transfer시간이 필요하다. Ø Transfer가 완료된 것을 확인하기 위해서, memb.을 Ponceau S, Amino Black나 India Ink로 염색해 볼 것. Ø Pre-stained MW marker을 사용해 볼 것 (R&D systems cat.#MW002)
Over transfer	Ø Protein의 MW이 10kDa이하일 경우, Voltage나 transfer 시간을 줄여 볼 것.
Isoelectric Point가 9이상	Ø CAPS(pH10.5)과 같은 pH가 높은 버퍼를 이용해 볼 것
2° 항체 선택 오류	Ø 1°항체의 host species와 Ig type을 확인 해 볼 것.
오래된 항체	Ø 만약 항체의 유효기간이 만료되거나, 보증 기간이 지난 경우, 새 항체를 구입하여 사용할 것.
항체의 보관 오류	Ø 제조사가 권고하는 저장 조건을 따르고, freeze/thaw cycles을 피할 것.
Sodium Azide 오염	Ø HRP signal을 약화시킬 수 있는 Sodium Azide이 첨가되지 않은 버퍼를 사용 할 것.
불충분한 1°항체 반응	Ø 4°C에서 overnight

Problem2: Faint Bands (Weak Signal)

가능한 원인	해결 방법
Low protein-antibody binding	Ø Washing 횟수를 최소화 할 것. Ø Wash buffer에 NaCl 농도를 줄여 볼 것 (0.15M~0.5M). Ø Antibody solutiom의 NaCl 농도를 줄여 볼 것(0.15M~0.5M).
Insufficient antibody	Ø Target protein에 항체의 affinity가 낮은 것이 원인일 수 있으므로, 항체의 적용 농도를 높여볼 것 (추천 시작 농도보다 2~4배 높게)
Insufficient protein	Ø 젤에 로딩하는 protein의 양을 늘려볼 것.
Inactive conjugate	Ø Enzyme과 substrate을 섞어서 발색반응을 확인 해 볼 것. 만약 발색되지 않거나 발색 정도가 약하다면 새로운 reagents을 구입할 것. ECL을 바뀔 것.
Weak/Old ECL	Ø 새로운 Enhanced Chemiluminescence(ECL)구입할 것.
Non-fat dry milk	Ø Blocking/ antibody solution의 not-fat dry milk 농도를 줄이거나, 3% BSA로 대체해 볼 것.

Problem3: Extra Bands

가능한 원인

해결 방법

1° 항체의 비특이적 반응

Ø 젤에 로딩하는 protein의 양을 줄여 볼 것

Ø Monoclonal이나 antigen affinity purified antibodies을 사용할 것

Ø 1 ° 항체의 농도를 줄여 볼 것

Bolded concentrations indicate he reduction of the primary antibody concentration.

A. Blocked in 5% milk,

1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl.

B. Blocked in 5% milk,

0.2 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl

2° 항체의 비특이적 반응

Ø 1° 항체를 제외하고 2°항체만 control로 실험해 볼 것.

( control test 결과 band가 보이면, 다른 2° 항체를 사용할 것)

Ø Monoclonal이나 antigen affinity purified antibodies을 사용할 것 (Cat.# BAFxx, HAFxx)

1°항체나 2°항체의 비 특이적 반응

Ø Antibody solution에 0.1~0.5% Tween^Ò20을 첨가해 볼 것.

Ø Washing 횟수를 늘려 볼 것.

Ø Wash buffer에 0.1~0.5% Tween^Ò20을 첨가해 볼

Ø 1°항체와 2°항체를 희석할 때 blotting buffer에 2% non-fat dry milk을 첨가하여 사용할 것. 항체 적용 농도를 필요에 따라 조정할 것.

Ø Antibody dilution와 Wash step에서 사용되는 buffer에 NaCl농도를 높여 볼 것 (추천 농도0.15M~0.5M)

Figure 2a – Effect of Varying Primary Antibody Concentration in Antibody Solution with 2% Milk:

Bolded concentrations indicate the dilution of the primary antibody concentration.

A. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 2% milk and 0.15 M NaCl.

B. Blocked in 5% milk, 0.3 microgram/mL primary antibody in 2% milk and 0.15 M NaCl.

C. Blocked in 5% milk, 0.1 microgram/mL primary antibody in 2% milk and 0.15 M NaCl.

Figure 2b – Effect of Varying Primary Antibody Concentration in Antibody Solution with 5% Milk:

In addition to the dilution of the primary antibody concentration (bolded), the milk concentration in the Antibody Solution was also increased.

D. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl.

E. Blocked in 5% milk, 0.3 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl.

F. Blocked in 5% milk, 0.1 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl.

Figure 2c – Effect of Varying NaCl Concentration in Blotting Buffer:

Bolded concentrations indicate the increased NaCl concentrations in the Blotting Buffer.

G. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl.

H. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.5 M NaCl.

Aggregation of analyte

Ø Disulfide bonds의 reduction을 위해 충분한 DTT을 첨가할 것

(추천 농도 20~100mM). gel에 loading 하기 전 5-10분 동안 water bath에서 heating해 줄 것.

Degradation of Analyte

Ø Brief centrifugation을 할 것.

Ø 샘플의 Freeze/thaw cycles을 최소화할 것.

Ø 샘플 저장 전에 protease inhibitors을 첨가 할 것.

Ø Fresh sample을 사용할 것.

Reagents 오염

Ø 미립자나 박테리아로 인한 버퍼 오염에 있는지 확인 할 것.

Ø Fresh Reagents을 만들어 사용할 것.

Problem4: High Background

가능한 원인	해결 방법
Insufficient blocking	Ø Start with 5% dry milk with 0.1~0.5% Tween 20, 0.15~0.5M의 NaCl in 25mM Tris(pH7.4). 반응 시간을 늘려보고, milk 농도를 조정해 볼 것. Ø Detergents가 낮은 온도에서 효과적이지 않을 수 있어, 4°C에서 overnight 반응에서 blocking efficiency가 떨어질 수 있다.
Non-fat dry milk가 target antigen을 포함하는 경우	Ø 3% BSA로 교체할 것.
Non-fat dry milk가 endogenous biotin을 포함하고 있어 Avidin/streptavidin complex형성에 영향	Ø 3% BSA로 교체할 것.
일부 IgY 항체가 milk protein을 인식	Ø 3% BSA로 교체할 것.
1° 항체의 비특이적 반응	Ø Monoclonal이나 antigen affinity purified antibodies을 사용할 것 Ø 5% milk blocking buffer 사용. 1°항체 solution의 Milk 농도(2~5%)나 NaCl농도(0.15~0.5M)를 조정해 볼 것. Figure 3 – Effect of Varying Milk and NaCl Concentrations: Bolded concentrations indicate adjustments in the milk and NaCl concentrations. A. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 2% milk and 0.15 M NaCl. B. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.5 M NaCl. Ø 1° 항체의 dilution/ wash buffers의 NaCl의 농도를 높여볼 것. (추천 농도 0.15~0.5M) Figure 4 – Effect of Varying NaCl Concentration in Blotting Buffer: Bolded concentrations indicate an increase in the NaCl concentration in the primary Antibody Solution. A. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.15 M NaCl. B. Blocked in 5% milk, 1.0 microgram/mL primary antibody in 5% milk and 0.5 M NaCl.
2° 항체의 비특이적 반응	Ø 1° 항체를 제외하고 2°항체만 control로 실험해 볼 것. (control test 결과 band가 보이면, 다른 2° 항체를 사용할 것)
Insufficient wash	Ø Wash 횟수를 늘려 볼 것 Ø Wash buffer의 Tween 20 (0.1~0.5%)의 농도를 높여 볼 것.
Film overexposed	Ø Exposure 시간을 줄일 것. Ø Target signal이 너무 강할 경우, 5-10분 기다린 후 re-expose할 것

Problem 5: Diffuse Bands

가능한 원인	해결 방법
Excessive protein on gel	Ø loading하는 protein양을 줄일 것.

Problem 6: White Bands (ECL method)

가능한 원인

해결 방법

Excessive signal generated

Ø 항체나 샘플의 농도를 줄일 것.

과도한 항체나 샘플양은 localized signal(주로 싱글 밴드에서)에서 high level을 유도할 수 있으며, 이 결과 그 부위에서만 substrate가 빠르게 소비되어 반응이 완료된다. 반응이 완료되면 더 이상 light production이 없기 때문에 필름에 exporsure시킬 때 white band가 나타난다.

Problem 7: Patch uneven spots all over the blot

가능한 원인	해결 방법
Reagents 오염	Ø 미립자나 박테리아로 인한 버퍼 오염에 있는지 확인 할 것. Ø Fresh Reagents을 만들어 사용할 것.
Incubation/wash 과정에서 버퍼 부족	Ø Incubation/wash 과정에서 membrane이 충분히 잠기도록 확인 할 것.
membrane상 공기방울	Ø 공기 방울을 조심해서 제거한다. 특히, transfer 단계에서 주의!
Incubation동안 uneven agitation	Ø Rocker/shaker가 놓여진 자리의 평균이 맞도록 확인할 것.
Contaminated equipment	Ø 전기영동 장치가 깨끗하게 잘 닦였는지 확인할 것. Protein이나 gel의 잔여물이 남아있게 되면, membrane에 붙을 수 있다. Membrane을 충분히 washing할 것.
HRP aggregation	Ø HRP aggregates을 제거하기 위해 filtering할 것.
Long exposure	Ø Exposure 시간을 줄여 볼 것.

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