IHC Troubleshooting guide

Problem 1: Lack of Staining

가능한 원인	해결 방법
Lack of antigen	ü In situ hybridization 으로 target protein의 발현을 확인
Abs의 활성이 떨어짐	ü 혹시 저장 방법이 틀리지 않았나 확인 ü Datasheet상에 안내되어 있는 저장방법을 따를 것. 일반적으로 aliquot하여, defrost freezer(-20 ~-70 °C)에서 보관하고 반복되는 Freeze-thaw을 피할 것.
1°항체나 2°항체의 비활성	ü 1°항체와 2°항체를 따로 따로 실험해 볼 것. (positive, negative control 이용)
불충분한 조직 고정	ü 고정 시간을 늘리거나, 다른 고정액을 사용해 볼 것.
조직의 과다 고정	ü 고정 시간을 줄여 볼 것. ü Antigen retrieval reagents 처리를 해 볼 것
부적절한 1°항체와 2°항체	ü 1°항체와 2°항체의 호환성을 확인해 볼 것. (예를 들어, 1°항체의 host animal이 rabbit이라면, 2°항체는 반드시 anti-rabbit 2°항체를 사용해야 함)
1°항체와 반응 전 antigen의 파괴	ü Peroxidase blocking 처리는 1°항체와 반응시키기 전에 처리한 경우, 1°항체 반응 후에 peroxidase blocking 처리를 할 것.
고정과 embedding과정 동안 epitope의 변형	ü Antigen retrieval을 해볼 것. ü Embedding 과정 시 온도를 58°C 이하에서 처리
Antigen retrieval 효과 없음	ü 처리 solution을 바꾸거나, 처리 시간을 길게 해 볼 것.
잘못된 실험 방법	ü 실험 방법을 확인하여 맞는 reagent를 사용할 것.

Problem 2: High Background

가능한 원인	해결 방법
1°항체나 2°항체의 농도	ü 항체의 고농도로 인해 background가 높게 나올 경우, 논문을 참고하여 serial dilution로 반응시켜 적정 농도를 찾아 볼 것.
항체와 항원의 소수성 반응	ü Antibody diluent의 ionic strength을 줄여 볼 것. (특히 단일클론 항체의 경우 salt 농도를 줄였을 때 반응이 잘 됨)
비특이성 반응	ü 1°항체 반응 전 blocking buffer를 처리 (예, R&D systems에서는 10% normal donkey serum에 1% BSA로 처리, non-fat dry milk는 선택사항)
샘플의 건조	ü 실험 과정 중 샘플이 마르는 것을 피할 것
오래되고 준비가 잘 되지 않은 slides 사용	ü Slides 에 남은 Reagents background가 생길 수 있으므로, 새로 준비된 깨끗한 slides을 사용 할 것.
Ionic interactions	ü Diluent buffer의 ionic strength을 증가시켜 줄 것.

Problem 3: Cell/ Tissue Morphology is Destroyed

가능한 원인	해결 방법
Antigen retrieval의 부주의한 처리	ü Antigen retrieval 과정 시 조심해서 처리하지 않으면, 샘플이 떨어져 나가거나 손상 될 수 있다. 여러 번의 실험을 통해 세부적인 조건 (처리시간, 온도) 등을 조절 할 것.
slide에서 샘플 분리 현상	ü Frozen 샘플의 경우 더 빈번. 고정액에서 처리 시간을 늘리고, 실험을 통해 고정액을 바꾸거나 추가 고정과정을 조정 할 것. ü 오래되지 않은 제대로 코팅된 slides을 사용 할 것.
샘플이 접히거나 손상된 현상. 공기 방울이 있는 현상	ü Sharp blade로 샘플을 다시 section하거나, 분석 시 손상 부분을 제외시킬 것. ü Mounting시 버블이 잘 생길 수 있으니 주의
샘플 형태의 손상으로 인한 낮은 해상도	ü Section을 두껍게 자를 것. ü Frozen 샘플의 경우, 얼음 결정이 샘플 형태의 손상에 영향을 줄 수 있다.
충분하지 않은 고정 과정	ü 고정액에서 처리 시간을 늘리거나 추가적인 고정액 처리. ü 고정액/샘플 비율을 높일 것. ü 고정 시 샘플의 전체 크기를 좀 더 작게 자를 것.
샘플의 자기분해 현상이 괴저성 잔여물의 염색을 유발	ü 고정액에서 처리 과정 시간, 비율을 높일 것. ü Cross-linking 고정액 사용을 고려해 볼 것.

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Q&A

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