Dynabeads Troubleshooting giude

1. Protein A/G beads , IP

2. M-280Tosylactivated beads

Protein A/G beads, IP

Q. Dynabeads를 이용해서 IP실험을 수행했습니다. 그런데 cross-linking시킨 후 IP실험을 해보니 gel 아무런 band도 확인이 되지 않았습니다.

A.

1) cross-linking과정에서 antibody의 binding site가 바뀌었을 가능성이 있습니다. 이럴 경우 antibody의 affinity가 줄어들거나 affinity를 보이지 않는 현상이 발생할 수 있습니다. 또한 cross-linking을 통해 non-specific target에 대한 affinity가 발생할 수도 있습니다. 이러한 현상은 cross-linking의 가장 큰 단점이며, 다른 covalent antibody coupling을 통해서 해결할 수 있습니다.

2) Dynabeads Antibody coupling kit을 이용하세요. 이 kit은 Dynabeads와 antibody의 covalent coupling시켜주는 solution입니다. Antibody coupling kit은 거의 모든 antibody에 적합합니다. 또한 이 kit은 Dynabeads와 antibody의 covalent coupling을 위해 만들어진 kit입니다. 이 kit은 cross-linking과는 다르게 antibody의 specificity나 affinity에 영향을 주지 않습니다.

Q. Dynabeads에 antibody를 cross-linking했지만 여전히 elution시에 antibody가 함께 나옵니다.

A. 모든 antibody에 대해서 100% cross-linking되지는 않습니다. 몇몇의 antibody들은 crosslinking되지 않아서 elution 될 수 잇습니다. Cross-linking후에 낮은 pH를 이용해서 washing하면 non cross-linking된 antibody를 제거할 수 있습니다. Wash 후 pH를 원래대로 돌려놓은 뒤 IP를 수행하세요.

Q. IP를 수행하기 전에 non cross-linking antibody를 제거했지만 여전히 gel에서 antibody가 보입니다.

A. 만약 gel loading전에 reducing agent를 사용하셨다면 reducing agent를 뺀 sample buffer를 사용해보세요. DTT나 beta-mercaptoethanol과 같은 reducing reagent들은 antibody내의 disulfide bridge를 끊어서 antibody의 light chain과 heavy chain을 release시킵니다. 또한 낮은 pH를 이용해서 protein을 elution하면 antibody와 bead의 binding이 유지될 것입니다.

Q. IP 실험에서 non-specific binding이 보입니다.

A. 조금 더 강한 washing buffer를 사용해보세요. Washing buffer에 non-ionic detergent (tween-20 or triton X-100)을 0.01-01사이의 농도로 넣으면 됩니다. 만약 beads가 침강 전에 block됐다면 washing buffer에 특정 blocker를 넣어주세요. 또한 washing 횟수를 늘리거나 washing step을 늘리거나 beads와 sample의 incubation 시간을 줄이거나 antibody의 농도를 줄이는 것도 한 방법입니다. 아니면 indirect 방법을 시도해보세요. Pre-clearing step 또한 non-specifically bind를 줄여줄 수 있습니다.

Q. Dynabeads G를 구매했습니다. Beads washing을 위해 beads와 PBS를 섞었는데 PBS 색이 붉은색으로 변하면서 beads와 magnet 사이의 부착력이 약해집니다.

A. Non-ionic detergent (Tween-20, Triton X-100, surfactant)를 최종 농도 0.01-0.1%가 되도록 넣어준 후 상온에서 5-10분 정도 incubation 시킵니다.

M-280 Tosylactivated beads

Q. Hydrophobic한 molecule과 M-280 Tosylactivated beads의 coupling 실험을 하는데 자꾸 beads가 끈적해져서 더 이상 실험 진행이 불가능합니다.

A. M-280 Tosylactivated beads를 이용한 coupling실험에는 총 세 개의 buffer가 필요한데요, 이 때 buffer C에는 ammonium sulphate가 포함되어 있습니다. 만일 coupling molecule의 storage buffer가 너무 hydrophobic할 경우 이 ammonium sulphate와 반응할 수 있는데요. 이 때 ammonium sulphate의 농도를 줄여서 실험하시면 됩니다.

학술 마케팅팀: 한소영  techserv@woongbee.com

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